熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)問世于20世紀(jì)70年代后期，是在原來的同位素原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是一種應(yīng)用非放射性熒光物質(zhì)依靠核酸探針雜交原理在核中或染色體上顯示核酸序列位置的方法。
熒光原位雜交技術(shù)基本原理是，按照兩個(gè)核酸的堿基序列互補(bǔ)原則，用特殊修飾的核苷酸分子標(biāo)記DNA探針，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體或DNA 纖維切片上，再與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體和探針分子特異性結(jié)合，經(jīng)熒光檢測系統(tǒng)和圖形分析技術(shù)對染色體或DNA纖維上的DNA序列定位、定性和相對定量。該技術(shù)具有快速，安全，靈敏度高以及探針可長期保存等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)，腫瘤生物學(xué)，基因定位，基因作圖，基因擴(kuò)增及分子診斷等領(lǐng)域。
熒光原位雜交的優(yōu)勢
1.試劑和探針無放射性，安全可控；
2.探針穩(wěn)定，可長期保存；
3.特異性好，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確。
4.FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；
5.多色FISH通過在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測多種序列；
6.既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。
實(shí)驗(yàn)流程
FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→染色體顯帶→熒光顯微鏡檢測→結(jié)果分析。
實(shí)驗(yàn)操作
1.設(shè)計(jì)探針要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要來進(jìn)行，也就是說你要檢測的目的基因決定你的探針設(shè)計(jì)。
2.組織切片4～5μm 厚，過厚或過薄的切片均會(huì)對信號(hào)的強(qiáng)弱產(chǎn)生影響，而且切片應(yīng)完整，質(zhì)量良好，否則會(huì)在預(yù)處理時(shí)掉片。載玻片的選擇建議使用防脫載玻片，有條件的實(shí)驗(yàn)室可使用更好的陽離子或者陰離子專用載玻片，可有效防止脫片現(xiàn)象的發(fā)生。
3.標(biāo)本的處理也是關(guān)系到最后信號(hào)強(qiáng)弱的關(guān)鍵，但有些人不注意這些細(xì)節(jié)，結(jié)果造成熒光信號(hào)弱，難以分辨。這與預(yù)處理不當(dāng)造成探針難以達(dá)到飽和而雜交難以進(jìn)行有關(guān)。
4.這一步是FISH關(guān)鍵中的關(guān)鍵。變性包括標(biāo)本變性和探針變性，這兩個(gè)步驟關(guān)系到FISH的成敗，千萬要嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，不但如此，特殊標(biāo)本還要自己摸條件。
5.操作熒光抗體的時(shí)候千萬要避光，否則將前功盡棄啊。在FISH，就是使用熒光顯微鏡觀察和記錄結(jié)果。在正常情況下，目前商業(yè)化的探針即使是雜交以后，熒光信號(hào)能保存半年之久。有時(shí)候，信號(hào)也會(huì)急劇衰減，幾分鐘后就不見了。出現(xiàn)這種情況，就是由于沒有嚴(yán)格避光。因此在觀察和記錄的時(shí)候，要盡可能地在暗室里面操作。
結(jié)果交付
1. 原始雜交顯色拍照結(jié)果圖片
2. 雜交后的切片，剩余探針等實(shí)驗(yàn)材料
3. 完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括實(shí)驗(yàn)過程、所用儀器試劑、蠟塊玻片和相關(guān)分析數(shù)據(jù)
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