CCK-8檢測(Cell Counting kit-8)
CCK-8細(xì)胞毒性試驗檢測為MTT法的替代方法,是一種基于WST(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四氮單鈉鹽),廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒性的檢測。
CCK-8(Cell Counting kit-8)試劑中含有WST–8:化學(xué)名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽,它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物(Formazan),生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,可采用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值,間接反映活細(xì)胞數(shù)量。
技術(shù)應(yīng)用
該方法已被廣泛用于大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增值實驗(1-6天)、細(xì)胞毒性實驗、藥物敏感度實驗、細(xì)胞基質(zhì)黏附實驗等。
實驗流程:
(1)客戶提供細(xì)胞株(凍存株或培養(yǎng)細(xì)胞)及處理用的藥物
(2)進行加藥處理及孵育時間
(3)檢測吸光度值
(4)進行數(shù)據(jù)分析及圖片
優(yōu)點:
(1)MTT被線粒體內(nèi)的一些脫氫還原酶還原成的formazan不是水溶性的,需要有特定的溶解液來溶解,而CCK-8產(chǎn)生的formazan都是水溶性的,可以省去后續(xù)的溶解步驟;
(2)CCK-8檢測靈敏度更高,更加穩(wěn)定;
(3)酚紅和血清對其測定無明顯影響;
(4)不必去上清,不必洗,滌細(xì)胞,更加簡便;
(5)對細(xì)胞無明顯毒性,加入顯色后,可以在不同時間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板,使檢測時間更加靈活,而且不影響細(xì)胞進行后續(xù)實驗。
在加藥實驗過程中對CCK-8測定的影響:
(1)注意如果藥物具有還原性,會和CCK-8發(fā)生顯色反應(yīng),增加吸光度。
(2)藥物中的金屬對CCK-8顯色有影響:當(dāng)終濃度為1mM的氯化亞鉛、氧化鐵、硫酸銅會抑制5%,15%, 90%的顯色反應(yīng),使靈敏度降級。如果終濃度是10mM的話,將會100%抑制。
解決辦法
首先要確認(rèn)藥物是否有吸收,在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8,測定450nm的吸光度,如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基(加CCK-8)的吸光度高,則證明藥物有影響,可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基,去掉藥物的影響。
(3)由于培養(yǎng)基中可能含有氧化還原反應(yīng)的物質(zhì),在正式實驗之前,建議使用一個孔作一下檢測,有必要先確認(rèn)培養(yǎng)基和CCK-8是否反應(yīng)。一般正常的0D值應(yīng)該在0.4以下。
空白對照
在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8,培養(yǎng)一定的時間,測定450nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細(xì)胞毒性實驗)時,還應(yīng)考慮藥物的吸收,可在不含細(xì)胞,加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8,培養(yǎng)一定的時間,測定450nm的吸光度作為空白對照。
靈敏度影響
(1)對于不同的細(xì)胞,靈敏度不一樣,懸浮細(xì)胞較貼壁細(xì)胞難染色。
(2)對于貼壁細(xì)胞,一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時吸光度已經(jīng)很高,但對于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低,可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細(xì)胞數(shù)量來解決。
細(xì)胞黏附性
(1)以層粘連蛋白(Ln)包被96孔板,通過計算不同時間點孔板中貼壁細(xì)胞的數(shù)量反映細(xì)胞的黏附性。
(2)細(xì)胞的黏附性越強,則單位時間內(nèi)貼于鋪有Ln板底的細(xì)胞數(shù)量越多,去除尚未貼壁的細(xì)胞后,應(yīng)用CCK-8等方法計量細(xì)胞數(shù)量便可間接反映不同細(xì)胞或不同處理的細(xì)胞黏附能力的差異。
藥物濃度檢測
將細(xì)胞培養(yǎng)后按照不同濃度的藥物處理-定時間后進行CCK-8檢測,根據(jù)吸光度繪制曲線,計算該藥物抑制細(xì)胞數(shù)量一半時的濃度(IC50)。