支原體污染 PCR 檢測試劑盒，用于檢測細胞培養(yǎng)中的支原體污染，也可作為支原體通用檢測試劑盒 使用，可檢測屬于柔膜菌綱(Mollicutes)的支原體（Mycoplasma）、脲原體（Ureaplasma）、無膽甾原體 （Acholeplasma）、螺原體（Spiroplasma）、蟲原體（Entomoplasma）、中間原體（Mesoplasma）等超過一 百種，但不適用于檢測嗜血支原體，與柔膜菌綱以外的其他生物沒有特異性反應(yīng)。
支原體，也有稱為霉形體、霉?jié){菌或微漿菌，是一種直徑約為 0.1-0.3 μm、無細胞壁的原核生物，屬 于柔膜菌綱(Mollicutes)，常被用作柔膜菌綱的統(tǒng)稱。具有變形能力，可透過常見過濾膜（0.22-0.45 μm）， 因此常規(guī)的無菌過濾方法不能將其去除，靶向細胞壁的抗生素也對支原體無效。支原體污染是基礎(chǔ)研究 和工業(yè)生產(chǎn)中一個很常見的問題，不同實驗室污染情況不盡相同，在一些不重視的實驗室，可能有高達 90%以上的細胞受到支原體污染。支原體在光學顯微鏡下不可見，對培養(yǎng)基的需求有限，一般不會引起培 養(yǎng)物混濁，因此細胞被支原體污染一般難以察覺。支原體污染能消耗營養(yǎng)物，促進代謝積累，導(dǎo)致 pH 改 變，誘導(dǎo)或抑制細胞因子表達，并改變培養(yǎng)細胞的代謝、增殖特征及形態(tài)。由于支原體污染能影響幾乎 每一個細胞參數(shù)，所以很多研究都強調(diào)常規(guī)檢測正在培養(yǎng)的細胞，以確保觀察到的結(jié)果不被支原體污染 所損害。支原體種類繁多，目前已知的污染細胞的支原體有 20 多種，一般是由試劑和人工操作帶入，95% 的污染事件是由常見的五種支原體引起；由原代細胞的原始組織帶入也可形成污染，此類污染的支原體 種類分布較為廣泛。
本試劑盒具有以下特點：
①特異性引物是針對高度保守的支原體 16S rRNA 序列設(shè)計的，可用于檢測 非常廣泛的支原體種類，不受真核細胞或細菌 DNA 干擾。經(jīng)本試劑盒測試的支原體菌株涵蓋了所有常見 的支原體污染種類；
②靈敏度極高，最低僅需 10 個拷貝的支原體基因組即可使檢測呈陽性；
③含陽性對 照，可幫助判斷假陰性現(xiàn)象；
④只需進行一次 PCR 反應(yīng)，使用方便。
| 貨號：iCell-MD01-001 | 規(guī)格：50 個反應(yīng) |
| 貨號：iCell-MD01-001 | 規(guī)格：100 個反應(yīng) |
試劑盒組份
組份 成份 體積（微升）
MD01-20 MD01-50 MD01-100
組份 A（藍蓋管） Taq 酶，dNTPs，染料 250 625 1250
組份 B（綠蓋管） 上下游引物 50 125 250
組份 C（黃蓋管） 陽性對照樣品 50 125 250
水（白蓋管） 無 DNA 酶超純水 200 500 1000
保存條件：保存于-20℃ , 避免反復(fù)凍融。沒有反復(fù)凍融的情況下，保質(zhì)期一年。
操作步驟：
1、樣品準備： 取 1 毫升細胞培養(yǎng)上清（貼壁和懸浮細胞都可以,最好已培養(yǎng) 48 小時以上），在 16000g 離心 5 分鐘，小心棄去上清，避免丟失沉淀（沉淀量有可能很少，目視看不到）。將沉淀用無菌 PBS 重懸， 在 16000g 離心 5 分鐘，同樣小心棄去上清，如此反復(fù)用無菌 PBS 洗三次。最后將獲得的沉淀用 100 微升 超純水重懸，置于 100℃水浴中孵育5 分鐘，如此獲得的 DNA 可在 4 度保存 1 到 2 個月。對于組成成份 較復(fù)雜的組織樣本或拭子，建議使用 DNA 抽提試劑盒提取 DNA。
2 、PCR 反應(yīng)的準備：
待試劑盒各組份在室溫融化后先瞬時離心，然后輕彈混勻。按下表在已滅菌的 PCR 管中配制反應(yīng)體
系，每次實驗均需加一個陰性和一個陽性對照，測試反應(yīng)管可以有多個。配制過程中應(yīng)注意無菌，戴口 罩，并注意避免操作產(chǎn)生的氣溶膠造成樣品間的交叉污染，推薦在有風壓的設(shè)備如超凈臺或生物安全柜 中進行操作。配制完畢后瞬時離心以使液體沉至管底。
本試劑盒非常靈敏，操作時產(chǎn)生的微量氣溶膠即可造成樣品之間的相互污染，因此須小心謹慎，避 免劇烈操作。加液時槍頭最好貼著管壁，所有管子用完即蓋，對照樣品和待測樣品留在最后一步加入，取過樣品的槍頭用完即棄，盡量減少操作時污染的可能性。
體積（微升） 陰性對照管 陽性對照管 測試反應(yīng)管*
組份 A 12.5 12.5 12.5
組份 B 2.5 2.5 2.5
組份 C - 2.5 2.5 / - *
水 10 7.5 5.5 / 8 *
待測樣品 - - 2
總體積 25 25 25
*組份C 可以提供一個排除假陰 性的方法：在不確定待測樣品是否 含有PCR 抑制物的情況下，可單獨 設(shè)置一管，將一個或多個待測樣品 與組份C 共同反應(yīng)，若無條帶出現(xiàn)， 則可判斷為PCR 反應(yīng)受到了抑制， 即存在PCR 抑制物，可能產(chǎn)生假陰 性結(jié)果。
3 、PCR 反應(yīng)
降落 PCR 法（Touchdown PCR）：94℃變性 2 分鐘；首循環(huán)：94℃變性 30 秒，68℃退火 30 秒，72℃ 延伸 45 秒；從第二到八個循環(huán)開始，每循環(huán)退火溫度下降 1℃, 其余不變；從第九個循環(huán)開始，反應(yīng)條 件固定為：94℃變性 30 秒，60℃退火 30 秒，72℃延伸 45 秒，循環(huán) 32 次；循環(huán)結(jié)束后，在 72℃延伸 7 分鐘，最后保持在 4℃。
4、瓊脂糖凝膠電泳：
按常規(guī)方法準備好 2%瓊脂糖凝膠，加入 EB 或 Gold-View 等用于顯色。每份反應(yīng)液取 8 微升，無須 加入上樣緩沖液，直接加入凝膠加樣孔中，另留一孔加入 DNA marker（最好在 400-700bp 區(qū)間有顯示條 帶），120 伏電泳約 30 分鐘。在紫外線下觀察電泳結(jié)果，陽性對照（組份 C）應(yīng)在 643bp 處有一條帶，陰 性對照無條帶，支原體陽性條帶在 438-470bp 區(qū)間。
1、組份 A 中含有染料，染料的加入不影響 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物可直接電泳，節(jié)省時間。
2、本試劑盒采用降落 PCR 法（退火溫度每循環(huán)降低一度），相比常規(guī) PCR 循環(huán)（退火溫度固定），靈 敏度和特異性均有明顯提高。與支原體親緣關(guān)系較近的一些革蘭氏陽性菌在反應(yīng)中的靈敏度較支原體低 1000-10000 倍，使用高濃度的純化基因組可能產(chǎn)生微弱的信號。這些革蘭氏陽性菌一般不會出現(xiàn)在細胞 培養(yǎng)物中，且由革蘭氏陽性菌引起的陽性在細胞污染檢測時是可以接受的，因此本試劑盒可以改用常規(guī) PCR 循環(huán)（退火溫度固定在60℃, 40 個循環(huán)）。
3、有些細胞的培養(yǎng)上清可直接進行 PCR 反應(yīng)，也有些細胞會產(chǎn)生抑制 PCR 反應(yīng)的代謝物，因此直接 使用上清可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果，故不建議此法。本試劑盒采用的 PBS 洗滌法可以在大多數(shù)情況下去除 PCR 抑制劑，如果去除不掉的話，則需要使用 DNA 抽提試劑盒提取支原體 DNA。絕大多數(shù) PCR 抑制劑可在提 取 DNA 的過程中去除，極少數(shù) PCR 抑制劑，如黑色素，DNA 抽提試劑盒也不能去除，此時可以通過加入 高濃度（如 2%）的 BSA（牛血清白蛋白）中和其抑制活性，或者降低樣品上樣量以降低 PCR 抑制劑在反 應(yīng)液中的濃度。
4 、本試劑盒僅供科研使用。
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